2 × Pfu PCR maisījums

Īpaši tīra augstas precizitātes Taq DNS polimerāze.

Pfu DNS polimerāze tiek ekspresēta no E.coli ar klonētu Pyrococus Furiosis DNS polimerāzes gēnu un tiek attīrīta un atdalīta ar vairāku kolonnu attīrīšanu. Tā kā Pfu ir 3′-5 ′ eksonukleāzes aktivitāte, tas var koriģēt DNS amplifikācijas procesā, bet tradicionālā Taq DNS polimerāze to nevar. Lai gan citām Taq DNS polimerāzēm, piemēram, Vent, Deep Vent, Tli, UITma uc, ir korektūras funkcijas, Pfu ir viszemākais neatbilstības rādītājs starp visām līdz šim konstatētajām Taq DNS polimerāzēm. Pfu DNS polimerāzei ir labāka termiskā stabilitāte nekā parastajai Taq DNS polimerāzei, un tā var uzturēt vairāk nekā 90% aktivitātes 95 ° C temperatūrā 1 stundu.

Vienas caurules Pfu PCR maisījums (valsts augsto tehnoloģiju produktu sertifikāts)

■ Pfu PCR maisījums ir uzlabojis PCR reakcijas specifiskumu un jutīgumu un var pastiprināt sarežģītas veidnes ar augstu GC saturu, sekundāro struktūru un tamlīdzīgi. Var papildināt tikai 2 mērķa veidnes kopijas, nodrošinot precīzākus eksperimenta rezultātus.

■ Unikālā Pfu MasterMix formula padara visu reakcijas sistēmu ļoti stabilu, un aktivitāti neietekmēs atkārtota sasaldēšana-atkausēšana vai ilgstoša uzglabāšana 4 ° C temperatūrā.

■ Stabils un efektīvs iepriekš sagatavots PCR maisījuma risinājums var padarīt darbību ātru un vienkāršu, ievērojami samazinot darba intensitāti un paraugu ņemšanas kļūdu. Komplektā ir iekļauts arī augstas veiktspējas PCR uzlabotājs un optimizētājs, kas samazina prasības PCR apstākļos.

■ Šim izstrādājumam ir gan krāsvielu saturošas, gan krāsvielas nesaturošas sistēmas. Krāsvielu saturošus PCR Mix produktus pēc PCR var tieši elektroforēt, nepievienojot parauga buferšķīdumu.

Kaķis Nē	Iepakojuma izmērs
4992780	1 ml
4992781	5*1 ml
4992782	1 ml
4992906	5*1 ml

Nosūtiet mums e -pastu

Produkta detaļas

Darbplūsma

Bieži uzdotie jautājumi

Produktu birkas

Darbības definīcija

1 vienības (U) Pfu DNS polimerāzes aktivitāte ir definēta kā fermenta daudzums, kas nepieciešams, lai 30 minūšu laikā 74 ° C temperatūrā 74 ° C temperatūrā iekļautu 10 nmol deoksinukleotīdus, par šablonu/primeru izmantojot aktivētu laša spermas DNS.

Kvalitātes kontrole

SDS-PAGE noteikšanas tīrība ir lielāka par 99%; Nav konstatēta eksogēnas nukleāzes aktivitāte; Viena eksemplāra gēnu cilvēka genomā varētu efektīvi pastiprināt; Ievērojamas aktivitātes izmaiņas nemainās, ja to vienu nedēļu uzglabā istabas temperatūrā.

Galvenie tehniskie parametri

Tam ir 3'-5 'eksonukleāzes aktivitāte un nav 5'-3' eksonukleāzes aktivitātes. DNS amplifikācijas pagarinājuma ātrums ir zemāks nekā Taq polimerāzei, un parasti Pfu enzīma pagarinājuma ātrums ir 0,5-1 kb minūtē. Pfu termiskā stabilitāte ir labāka nekā Taq. Veidnēm ar augstu GC saturu denaturācijas temperatūru var paaugstināt līdz 98 ° C, kas neietekmē Pfu polimerāzes aktivitāti. PCR produktam ir neass gals, ko var pievienot ar 3'-dA pārkares, pirms to sasaistīt ar TA vektoru vai klonēt ar vāju galu vektoru

Lietojumprogrammas

To var izmantot augstas precizitātes DNS amplifikācijai, piemēram, gēnu ekspresijas klonēšanai, uz vietu vērstajai mutācijai, viena nukleotīda polimorfisma (SNP) analīzei un gala labošanai.

Visus produktus var pielāgot ODM/OEM. Lai iegūtu sīkāku informāciju,lūdzu, noklikšķiniet uz Pielāgots pakalpojums (ODM/OEM)

Iepriekšējais: Ātrs uz vietas vērsts mutagēzes komplekts

Nākamais: Ultra HiFidelity PCR komplekts

Izmantojiet genoma DNS kā veidni, lai pastiprinātu 1 kb fragmentu.
Pēc PCR reakcijas ņem 5 μl elektroforēzes noteikšanai.

J: Nav pastiprināšanas joslu

A-1 veidne

■ Šablons satur olbaltumvielu piemaisījumus vai Taq inhibitorus utt. —— Notīriet DNS veidni, noņemiet olbaltumvielu piemaisījumus vai ekstrahējiet veidnes DNS ar attīrīšanas komplektiem.

■ Šablona denaturācija nav pabeigta ——Pienācīgi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

■ Veidnes pasliktināšanās-atkārtoti sagatavojiet veidni.

A-2 Primer

■ Slikta praimeru kvalitāte-atkārtoti sintezējiet grunti.

■ Gruntējuma noārdīšanās —— Saglabājiet augstas koncentrācijas praimerus nelielā tilpumā. Izvairieties no vairākkārtējas sasalšanas un atkausēšanas vai ilgstošas 4 ° C konservēšanas.

■ Nepareiza gruntējuma konstrukcija (piemēram, gruntējuma garums nav pietiekams, starp primeriem izveidojies dimērs utt.)

A-3 Mg²⁺koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Augsta atlaidināšanas temperatūra ietekmē gruntējuma un šablona saistīšanos. —–Samaziniet atlaidināšanas temperatūru un optimizējiet stāvokli ar 2 ° C gradientu.

A-5 Pagarināšanas laiks

■ Īss pagarinājuma laiks - pagariniet pagarinājuma laiku.

J: Viltus pozitīvs

Parādības: Negatīvie paraugi parāda arī mērķa secības joslas.

A-1 PCR piesārņojums

■ Mērķsekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums - uzmanīgi nepipetējiet paraugu, kas satur mērķa secību negatīvajā paraugā, un neizlejiet tos no centrifūgas mēģenes. Reaģentus vai aprīkojumu vajadzētu autoklāvēt, lai likvidētu esošās nukleīnskābes, un piesārņojuma esamība jānosaka ar negatīvas kontroles eksperimentiem.

■ Reaģentu piesārņojums —— reaģentus izlīdziniet un uzglabājiet zemā temperatūrā.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

■ Nepareizs gruntējuma dizains un mērķa secībai ir homoloģija ar mērķa secību. —–Pārveidojiet gruntējumus.

J: Nespecifiska pastiprināšana

Parādības: PCR amplifikācijas joslas neatbilst gaidāmajam izmēram, vai nu lielam, vai mazam, vai dažreiz rodas gan specifiskas amplifikācijas joslas, gan nespecifiskas amplifikācijas joslas.

A-1 Primer

■ Slikta gruntējuma specifika

——Pārveidot gruntējumu.

■ Gruntējuma koncentrācija ir pārāk augsta - Pareizi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

A-2 Mg²⁺ koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta —— Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-3 Termostabila polimerāze

■ Pārmērīgs fermentu daudzums - atbilstoši samaziniet fermentu daudzumu ar 0,5 V intervālu.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Rūdīšanas temperatūra ir pārāk zema ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru vai izmantojiet divpakāpju atlaidināšanas metodi

A-5 PCR cikli

■ Pārāk daudz PCR ciklu - samaziniet PCR ciklu skaitu.

J: Patchy vai uztriepes joslas

A-1 Primer—— slikta specifika —— pārprojektējiet grunti, mainiet gruntējuma atrašanās vietu un garumu, lai uzlabotu tā specifiskumu; vai veikt ligzdotu PCR.

A-2 veidnes DNS

- Šablons nav tīrs. - Attīriet veidni vai iegūstiet DNS ar attīrīšanas komplektiem.

A-3 Mg²⁺ koncentrēšanās

- Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta - pareizi samaziniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 dNTP

——DNTP koncentrācija ir pārāk augsta —–Pienācīgi samaziniet dNTP koncentrāciju

A-5 Rūdīšanas temperatūra

——Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru

A-6 cikli

——Pārāk daudz ciklu —— Optimizējiet cikla numuru

J: Cik daudz veidnes DNS jāpievieno 50 μl PCR reakcijas sistēmā?

J: Kā pastiprināt garus fragmentus?

Pirmais solis ir izvēlēties piemērotu polimerāzi. Parastā Taq polimerāze nevar tikt koriģēta 3'-5 'eksonukleāzes aktivitātes trūkuma dēļ, un neatbilstība ievērojami samazinās fragmentu pagarināšanas efektivitāti. Tāpēc parastā Taq polimerāze nevar efektīvi pastiprināt mērķa fragmentus, kas lielāki par 5 kb. Taq polimerāze ar īpašu modifikāciju vai cita augstas precizitātes polimerāze jāizvēlas, lai uzlabotu pagarinājuma efektivitāti un apmierinātu garu fragmentu pastiprināšanas vajadzības. Turklāt garu fragmentu pastiprināšanai ir nepieciešama arī atbilstoša gruntējuma konstrukcijas, denaturācijas laika, pagarinājuma laika, bufera pH korekcija utt. Parasti primeri ar 18-24 bp var radīt labāku ražu. Lai novērstu šablona bojājumus, denaturācijas laiks pie 94 ° C cikla laikā jāsamazina līdz 30 sekundēm vai mazāk, un laikam, līdz temperatūras paaugstināšanai līdz 94 ° C pirms amplifikācijas jābūt mazākam par 1 min. Turklāt, pagarināšanas temperatūras iestatīšana aptuveni 68 ° C un pagarinājuma laika izstrāde atbilstoši ātrumam 1 kb/min, var nodrošināt garu fragmentu efektīvu pastiprināšanu.

J: Kā uzlabot PCR pastiprināšanas precizitāti?

PCR amplifikācijas kļūdu līmeni var samazināt, izmantojot dažādas DNS polimerāzes ar augstu precizitāti. Starp visām līdz šim atrastajām Taq DNS polimerāzēm Pfu fermentam ir zemākais kļūdu īpatsvars un visaugstākā precizitāte (skatīt pievienoto tabulu). Papildus fermentu izvēlei pētnieki var vēl vairāk samazināt PCR mutāciju ātrumu, optimizējot reakcijas apstākļus, tostarp optimizējot bufera sastāvu, termostabilās polimerāzes koncentrāciju un optimizējot PCR cikla skaitu.

Uzrakstiet savu ziņu šeit un nosūtiet to mums