2 × Taq Platinum PCR maisījums
Darbības definīcija
1 vienība (U) Taq platīna DNS polimerāzes aktivitāte tiek definēta kā fermenta daudzums, kas nepieciešams, lai 30 minūšu laikā 74 ° C temperatūrā 74 ° C temperatūrā 30 nm laikā iekļautu 10 nmol deoksinukleotīdus, izmantojot šablonu/primeru aktivētu laša spermas DNS.
Kvalitātes kontrole
SDS-PAGE noteikšanas tīrība ir lielāka par 99%; Nav konstatēta eksogēnas nukleāzes aktivitāte; Viena eksemplāra gēnu cilvēka genomā varētu efektīvi pastiprināt; Ievērojamas aktivitātes izmaiņas nemainās, ja to vienu nedēļu uzglabā istabas temperatūrā.
Galvenie tehniskie parametri
Tam ir 5'-3 'eksonukleāzes aktivitāte un 3'-5' eksonukleāzes aktivitāte, un tā precizitāte ir blakus Pfu polimerāzei. Taq Platinum polimerāzes pagarinājuma ātrums ir ātrāks nekā Pfu polimerāze, un pastiprināšanas efektivitāte ir augstāka. PCR produktus var tieši ligēt uz neasu galu vai klonēt ar TA vektoru. Ja klonēšanas efektivitāte ir jāuzlabo, pirms klonēšanas TA vektorā ieteicams vispirms attīrīt un pievienot 3'-dA pārkares.
Vienas caurules Taq Platinum MasterMix (valsts augsto tehnoloģiju produktu sertifikācija)
■ Taq Platinum MasterMix ir uzlabojis PCR reakcijas specifiskumu un jutīgumu un var pastiprināt sarežģītas veidnes ar augstu GC saturu, sekundāro struktūru un tamlīdzīgi. Var papildināt tikai 2 mērķa veidnes kopijas, nodrošinot precīzākus eksperimenta rezultātus.
■ Unikālā Taq Platinum MasterMix formula padara visu reakcijas sistēmu ļoti stabilu, un aktivitāti neietekmēs atkārtota sasaldēšana-atkausēšana vai ilgstoša uzglabāšana 4 ° C temperatūrā.
■ Stabils un efektīvs iepriekš sagatavots PCR jauktais šķīdums var padarīt darbību ātru un vienkāršu, ievērojami samazinot darba intensitāti un paraugu ņemšanas kļūdu. Komplektā ir iekļauts arī augstas veiktspējas PCR uzlabotājs un optimizētājs, kas samazina prasības PCR apstākļos.
■ Šim izstrādājumam ir gan krāsvielu saturošas, gan krāsvielas nesaturošas sistēmas. Krāsvielu saturošus MasterMix produktus var tieši elektroforēt pēc PCR, nepievienojot iekraušanas buferšķīdumu.
Lietojumprogrammas
Tas var aizstāt Pfu polimerāzi, lai pastiprinātu augstas precizitātes produktus no sarežģītām veidnēm, piemēram, genomiem, un tas ir piemērots tādiem lietojumiem kā ekspresijas gēnu klonēšana, vietnei specifiskas mutācijas un viena nukleotīda polimorfisma (SNP) analīze utt.
Piesardzības pasākumi, veidojot PCR primerus:
Gruntēšanas garums parasti ir 20-25 mer. Tomēr, veicot garu fragmenta PCR, gruntējuma garums jāpalielina līdz 30-35 mer.
■ Starp abiem primeriem nav papildinoša savienojuma, it īpaši pēdējām 3 bāzēm 3 ′ galā.
■ GC saturam jābūt 50–60%un jāizvairās no vietējiem bagātīgiem GC vai AT. Lai gruntējums un šablons stabili saistītos, izvairieties no AT bagātas struktūras 3 ′ galā.
■ Izvairieties no gruntēšanas, lai izveidotu sekundāro struktūru.
■ Izvēlieties divus gruntētājus ar Tm temperatūru tuvu viens otram.
Primeru Tm vērtības aprēķins PCR:
■ Ja gruntējums ir mazāks par 20 mer: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).
■ Ja gruntējums ir lielāks par 20 mer: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/L, kur L ir gruntējuma garums.
■ Iestatiet atlaidināšanas temperatūru (Tm-5) ° C.
PCR gruntējuma ievade
Atbilstošo primeru galīgo koncentrāciju var izvēlēties no 0,1 μM līdz 1,0 μM. Pārāk zema praimeru koncentrācija rada zemu amplifikācijas produktu iznākumu, savukārt pārāk augsta gruntējuma koncentrācija ir vairāk pakļauta nespecifiskai amplifikācijai. Parasti, ja veidnes DNS daudzums ir liels vai kā veidne tiek izmantota sarežģīta šablona DNS (piemēram, cilvēka genoma DNS), praimeru koncentrācijai jābūt zemākai. Ja veidnes DNS daudzums ir mazs vai kā šablons tiek izmantota vienkārša šablona DNS (piemēram, plazmīda DNS utt.), Praimeru koncentrācijai jābūt lielākai.
Visus produktus var pielāgot ODM/OEM. Lai iegūtu sīkāku informāciju,lūdzu, noklikšķiniet uz Pielāgots pakalpojums (ODM/OEM)
  |
Izmantojiet genoma DNS kā veidni, lai pastiprinātu 1 kb fragmentu. Pēc PCR reakcijas ņemiet 5 μl elektroforēzes noteikšanai. |
A-1 veidne
■ Šablons satur olbaltumvielu piemaisījumus vai Taq inhibitorus utt. —— Notīriet DNS veidni, noņemiet olbaltumvielu piemaisījumus vai ekstrahējiet veidnes DNS ar attīrīšanas komplektiem.
■ Šablona denaturācija nav pabeigta ——Pienācīgi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.
■ Veidnes pasliktināšanās-atkārtoti sagatavojiet veidni.
A-2 Primer
■ Slikta praimeru kvalitāte-atkārtoti sintezējiet grunti.
■ Gruntējuma noārdīšanās —— Saglabājiet augstas koncentrācijas praimerus nelielā tilpumā. Izvairieties no vairākkārtējas sasalšanas un atkausēšanas vai ilgstošas 4 ° C konservēšanas.
■ Nepareiza gruntējuma konstrukcija (piemēram, gruntējuma garums nav pietiekams, starp primeriem izveidojies dimērs utt.)
A-3 Mg2+koncentrēšanās
■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.
A-4 Rūdīšanas temperatūra
■ Augsta atlaidināšanas temperatūra ietekmē gruntējuma un šablona saistīšanos. —–Samaziniet atlaidināšanas temperatūru un optimizējiet stāvokli ar 2 ° C gradientu.
A-5 Pagarināšanas laiks
■ Īss pagarinājuma laiks - pagariniet pagarinājuma laiku.
Parādības: Negatīvie paraugi parāda arī mērķa secības joslas.
A-1 PCR piesārņojums
■ Mērķsekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums - uzmanīgi nepipetējiet paraugu, kas satur mērķa secību negatīvajā paraugā, un neizlejiet tos no centrifūgas mēģenes. Reaģentus vai aprīkojumu vajadzētu autoklāvēt, lai likvidētu esošās nukleīnskābes, un piesārņojuma esamība jānosaka ar negatīvas kontroles eksperimentiem.
■ Reaģentu piesārņojums —— reaģentus izlīdziniet un uzglabājiet zemā temperatūrā.
A-2 Primer
■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.
■ Nepareizs gruntējuma dizains un mērķa secībai ir homoloģija ar mērķa secību. —–Pārveidojiet gruntējumus.
Parādības: PCR amplifikācijas joslas neatbilst gaidāmajam izmēram, vai nu lielam, vai mazam, vai dažreiz rodas gan specifiskas amplifikācijas joslas, gan nespecifiskas amplifikācijas joslas.
A-1 Primer
■ Slikta gruntējuma specifika
——Pārveidot gruntējumu.
■ Gruntējuma koncentrācija ir pārāk augsta - Pareizi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.
A-2 Mg2+ koncentrēšanās
■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta —— Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.
A-3 Termostabila polimerāze
■ Pārmērīgs fermentu daudzums - atbilstoši samaziniet fermentu daudzumu ar 0,5 V intervālu.
A-4 Rūdīšanas temperatūra
■ Rūdīšanas temperatūra ir pārāk zema ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru vai izmantojiet divpakāpju atlaidināšanas metodi
A-5 PCR cikli
■ Pārāk daudz PCR ciklu - samaziniet PCR ciklu skaitu.
A-1 Primer—— slikta specifika —— pārprojektējiet grunti, mainiet gruntējuma atrašanās vietu un garumu, lai uzlabotu tā specifiskumu; vai veikt ligzdotu PCR.
A-2 veidnes DNS
- Šablons nav tīrs. - Attīriet veidni vai iegūstiet DNS ar attīrīšanas komplektiem.
A-3 Mg2+ koncentrēšanās
- Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta - pareizi samaziniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.
A-4 dNTP
——DNTP koncentrācija ir pārāk augsta —–Pienācīgi samaziniet dNTP koncentrāciju
A-5 Rūdīšanas temperatūra
——Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru
A-6 cikli
——Pārāk daudz ciklu —— Optimizējiet cikla numuru
Pirmais solis ir izvēlēties piemērotu polimerāzi. Parastā Taq polimerāze nevar tikt koriģēta 3'-5 'eksonukleāzes aktivitātes trūkuma dēļ, un neatbilstība ievērojami samazinās fragmentu pagarināšanas efektivitāti. Tāpēc parastā Taq polimerāze nevar efektīvi pastiprināt mērķa fragmentus, kas lielāki par 5 kb. Taq polimerāze ar īpašu modifikāciju vai cita augstas precizitātes polimerāze jāizvēlas, lai uzlabotu pagarinājuma efektivitāti un apmierinātu garu fragmentu pastiprināšanas vajadzības. Turklāt garu fragmentu pastiprināšanai ir nepieciešama arī atbilstoša gruntējuma konstrukcijas, denaturācijas laika, pagarinājuma laika, bufera pH korekcija utt. Parasti primeri ar 18-24 bp var radīt labāku ražu. Lai novērstu šablona bojājumus, denaturācijas laiks pie 94 ° C cikla laikā jāsamazina līdz 30 sekundēm vai mazāk, un laikam, līdz temperatūras paaugstināšanai līdz 94 ° C pirms amplifikācijas jābūt mazākam par 1 min. Turklāt, pagarināšanas temperatūras iestatīšana aptuveni 68 ° C un pagarinājuma laika izstrāde atbilstoši ātrumam 1 kb/min, var nodrošināt garu fragmentu efektīvu pastiprināšanu.
PCR amplifikācijas kļūdu līmeni var samazināt, izmantojot dažādas DNS polimerāzes ar augstu precizitāti. Starp visām līdz šim atrastajām Taq DNS polimerāzēm Pfu fermentam ir zemākais kļūdu īpatsvars un visaugstākā precizitāte (skatīt pievienoto tabulu). Papildus fermentu izvēlei pētnieki var vēl vairāk samazināt PCR mutāciju ātrumu, optimizējot reakcijas apstākļus, tostarp optimizējot bufera sastāvu, termostabilās polimerāzes koncentrāciju un optimizējot PCR cikla skaitu.
Produktu kategorijas
KĀPĒC IZVĒLĒTIES MUMS
Kopš tās izveides mūsu rūpnīca ir izstrādājusi pirmās pasaules klases produktus, ievērojot principu
vispirms par kvalitāti. Mūsu produkti ir ieguvuši izcilu reputāciju nozarē un uzticamību jauno un veco klientu vidū.
- Tālr .: +86 010-59822688
- Ēka 5, Nr. 86, Shuangying West Road, Changping rajons, Pekina.
- people@tiangen.com
