Ātrs uz vietas vērsts mutagēzes komplekts

A-1 veidne

■ Šablons satur olbaltumvielu piemaisījumus vai Taq inhibitorus utt. —— Notīriet DNS veidni, noņemiet olbaltumvielu piemaisījumus vai ekstrahējiet veidnes DNS ar attīrīšanas komplektiem.

■ Šablona denaturācija nav pabeigta ——Pienācīgi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

■ Veidnes pasliktināšanās-atkārtoti sagatavojiet veidni.

A-2 Primer

■ Slikta praimeru kvalitāte-atkārtoti sintezējiet grunti.

■ Gruntējuma noārdīšanās —— Saglabājiet augstas koncentrācijas praimerus nelielā tilpumā. Izvairieties no vairākkārtējas sasalšanas un atkausēšanas vai ilgstošas ​​4 ° C konservēšanas.

■ Nepareiza gruntējuma konstrukcija (piemēram, gruntējuma garums nav pietiekams, starp primeriem izveidojies dimērs utt.)

A-3 Mg²⁺koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Augsta atlaidināšanas temperatūra ietekmē gruntējuma un šablona saistīšanos. —–Samaziniet atlaidināšanas temperatūru un optimizējiet stāvokli ar 2 ° C gradientu.

A-5 Pagarināšanas laiks

■ Īss pagarinājuma laiks - pagariniet pagarinājuma laiku.

Parādības: Negatīvie paraugi parāda arī mērķa secības joslas.

A-1 PCR piesārņojums

■ Mērķsekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums - uzmanīgi nepipetējiet paraugu, kas satur mērķa secību negatīvajā paraugā, un neizlejiet tos no centrifūgas mēģenes. Reaģentus vai aprīkojumu vajadzētu autoklāvēt, lai likvidētu esošās nukleīnskābes, un piesārņojuma esamība jānosaka ar negatīvas kontroles eksperimentiem.

■ Reaģentu piesārņojums —— reaģentus izlīdziniet un uzglabājiet zemā temperatūrā.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

■ Nepareizs gruntējuma dizains un mērķa secībai ir homoloģija ar mērķa secību. —–Pārveidojiet gruntējumus.

Parādības: PCR amplifikācijas joslas neatbilst gaidāmajam izmēram, vai nu lielam, vai mazam, vai dažreiz rodas gan specifiskas amplifikācijas joslas, gan nespecifiskas amplifikācijas joslas.

A-1 Primer

■ Slikta gruntējuma specifika

——Pārveidot gruntējumu.

■ Gruntējuma koncentrācija ir pārāk augsta - Pareizi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

A-2 Mg²⁺ koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta —— Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-3 Termostabila polimerāze

■ Pārmērīgs fermentu daudzums - atbilstoši samaziniet fermentu daudzumu ar 0,5 V intervālu.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Rūdīšanas temperatūra ir pārāk zema ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru vai izmantojiet divpakāpju atlaidināšanas metodi

A-5 PCR cikli

■ Pārāk daudz PCR ciklu - samaziniet PCR ciklu skaitu.

A-1 Primer—— slikta specifika —— pārprojektējiet grunti, mainiet gruntējuma atrašanās vietu un garumu, lai uzlabotu tā specifiskumu; vai veikt ligzdotu PCR.

A-2 veidnes DNS

- Šablons nav tīrs. - Attīriet veidni vai iegūstiet DNS ar attīrīšanas komplektiem.

A-3 Mg²⁺ koncentrēšanās

- Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta - pareizi samaziniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 dNTP

——DNTP koncentrācija ir pārāk augsta —–Pienācīgi samaziniet dNTP koncentrāciju

A-5 Rūdīšanas temperatūra

——Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru

A-6 cikli

——Pārāk daudz ciklu —— Optimizējiet cikla numuru

Pirmais solis ir izvēlēties piemērotu polimerāzi. Parastā Taq polimerāze nevar tikt koriģēta 3'-5 'eksonukleāzes aktivitātes trūkuma dēļ, un neatbilstība ievērojami samazinās fragmentu pagarināšanas efektivitāti. Tāpēc parastā Taq polimerāze nevar efektīvi pastiprināt mērķa fragmentus, kas lielāki par 5 kb. Taq polimerāze ar īpašu modifikāciju vai cita augstas precizitātes polimerāze jāizvēlas, lai uzlabotu pagarinājuma efektivitāti un apmierinātu garu fragmentu pastiprināšanas vajadzības. Turklāt garu fragmentu pastiprināšanai ir nepieciešama arī atbilstoša gruntējuma konstrukcijas, denaturācijas laika, pagarinājuma laika, bufera pH korekcija utt. Parasti primeri ar 18-24 bp var radīt labāku ražu. Lai novērstu šablona bojājumus, denaturācijas laiks pie 94 ° C cikla laikā jāsamazina līdz 30 sekundēm vai mazāk, un laikam, līdz temperatūras paaugstināšanai līdz 94 ° C pirms amplifikācijas jābūt mazākam par 1 min. Turklāt, pagarināšanas temperatūras iestatīšana aptuveni 68 ° C un pagarinājuma laika izstrāde atbilstoši ātrumam 1 kb/min, var nodrošināt garu fragmentu efektīvu pastiprināšanu.

PCR amplifikācijas kļūdu līmeni var samazināt, izmantojot dažādas DNS polimerāzes ar augstu precizitāti. Starp visām līdz šim atrastajām Taq DNS polimerāzēm Pfu fermentam ir zemākais kļūdu īpatsvars un visaugstākā precizitāte (skatīt pievienoto tabulu). Papildus fermentu izvēlei pētnieki var vēl vairāk samazināt PCR mutāciju ātrumu, optimizējot reakcijas apstākļus, tostarp optimizējot bufera sastāvu, termostabilās polimerāzes koncentrāciju un optimizējot PCR cikla skaitu.