TIANSeq NGS bibliotēkas pastiprināšanas modulis

Pašlaik augstas caurlaidības sekvencēšanas tehnoloģija galvenokārt balstās uz nākamās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģiju. Tā kā nākamās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģijas lasīšanas garums ir ierobežots, mums ir jāsadala visa garuma secība mazās fragmentu bibliotēkās. Atbilstoši dažādu sekvencēšanas eksperimentu vajadzībām mēs parasti izvēlamies vienpusēju vai divpusēju sekvencēšanu. Pašlaik nākamās paaudzes sekvencēšanas bibliotēkas DNS fragmenti parasti tiek izplatīti diapazonā no 200 līdz 800 bp.

a) DNS ir sliktas kvalitātes un satur inhibitorus. Izmantojiet augstas kvalitātes DNS paraugus, lai izvairītos no fermentu aktivitātes kavēšanas.

b) DNS parauga daudzums ir nepietiekams, ja DNS bibliotēkas izveidošanai izmanto metodi bez PCR. Ja sadrumstalotās DNS ievade pārsniedz 50 ng, bibliotēkas veidošanas procesā var selektīvi veikt darbplūsmu bez PCR. Ja bibliotēkas kopiju skaits ir pārāk zems, lai to varētu tieši sekvencēt, DNS bibliotēku pēc adaptera ligācijas var pastiprināt ar PCR.

c) RNS piesārņojums noved pie neprecīzas sākotnējās DNS kvantitatīvās noteikšanas RNS piesārņojums var pastāvēt genoma DNS attīrīšanas procesā, kas var izraisīt neprecīzu DNS kvantitatīvu noteikšanu un nepietiekamu DNS ielādi bibliotēkas veidošanas laikā. RNS var noņemt, apstrādājot ar RNāzi.

A-1

a) Parādās mazi fragmenti (60 bp-120 bp) Mazi fragmenti parasti ir adaptera fragmenti vai adapteri. Attīrīšana ar Agencourt AMPure XP magnētiskajām lodītēm var efektīvi noņemt šos adaptera fragmentus un nodrošināt sekvencēšanas kvalitāti.

b) Pēc PCR amplifikācijas bibliotēkā parādās lieli fragmenti Bibliotēkas DNS fragmenta izmērs palielināsies par 120 bp pēc adaptera ligēšanas. Ja DNS fragments pēc adaptera ligācijas palielinās par vairāk nekā 120 bp, to var izraisīt pārmērīga PCR amplifikācijas patoloģiska fragmenta amplifikācija. Samazinot PCR ciklu skaitu, var novērst situāciju.

c) Nenormāls bibliotēkas DNS fragmentu izmērs pēc adaptera sasiešanas Adaptera garums šajā komplektā ir 60 bp. Kad fragmenta abi gali tiek piesaistīti adapteriem, garums palielināsies tikai par 120 bp. Ja izmantojat adapteri, kas nav komplektā, lūdzu, sazinieties ar piegādātāju, lai sniegtu atbilstošu informāciju, piemēram, adaptera garumu. Lūdzu, pārliecinieties, ka eksperimenta darbplūsma un darbība atbilst rokasgrāmatā aprakstītajām darbībām.

d) Nenormāls DNS fragmenta izmērs pirms adaptera ligācijas Šīs problēmas iemesls var būt nepareizi reakcijas apstākļi DNS fragmentācijas laikā. Dažādai DNS ievadīšanai jāizmanto dažādi reakcijas laiki. Ja DNS ievade ir lielāka par 10 ng, mēs iesakām kā optimizācijas sākuma laiku izvēlēties reakcijas laiku 12 min, un šajā laikā saražotā fragmenta lielums galvenokārt ir robežās no 300 līdz 500 bp. Lietotāji var palielināt vai samazināt DNS fragmentu garumu 2-4 minūtes atbilstoši savām prasībām, lai optimizētu vajadzīgā izmēra DNS fragmentus.

A-2

a) Sadrumstalotības laiks nav optimizēts Ja sadrumstalotā DNS ir pārāk maza vai pārāk liela, lūdzu, skatiet instrukcijā sniegtos fragmentācijas laika izvēles norādījumus, lai noteiktu reakcijas laiku, un izmantojiet šo laika punktu kā kontroli, papildus iestatiet reakcijas sistēmu, lai pagarinātu vai saīsinātu 3 minūtes, lai precīzāk pielāgotu sadrumstalotības laiku.

A-3

Nenormāls DNS sadalījums pēc fragmentācijas apstrādes

a) Nepareiza sadrumstalotības reaģenta atkausēšanas metode vai reaģents pēc atkausēšanas nav pilnībā sajaukts. Atkausējiet 5 × fragmentācijas enzīmu maisījuma reaģentu uz ledus. Pēc atkausēšanas vienmērīgi samaisiet reaģentu, viegli uzsitot caurulītes dibenā. Ne virpiniet reaģentu!

b) DNS ievades paraugs satur EDTA vai citus piesārņotājus. Sāls jonu un helātu veidojošo vielu izsīkšana DNS attīrīšanas posmā ir īpaši svarīga eksperimenta veiksmīgai norisei. Ja DNS izšķīdina 1 × TE, sadrumstalotības veikšanai izmantojiet instrukcijā sniegto metodi. Ja EDTA koncentrācija šķīdumā ir neskaidra, ieteicams DNS attīrīt un izšķīdināt dejonizētā ūdenī turpmākai reakcijai.

c) Nepareiza sākotnējā DNS kvantitatīvā noteikšana Sadrumstalotās DNS lielums ir cieši saistīts ar ievadītās DNS daudzumu. Pirms fragmentācijas apstrādes ir nepieciešama precīza DNS kvantitatīva noteikšana, izmantojot Qubit, Picogreen un citas metodes, lai noteiktu precīzu DNS daudzumu reakcijas sistēmā.

 d) Reakcijas sistēmas sagatavošana neatbilst norādījumiem Sadrumstalotās reakcijas sistēmas sagatavošana jāveic uz ledus stingri saskaņā ar instrukcijām. Lai nodrošinātu vislabāko efektu, visas reakcijas sastāvdaļas jānovieto uz ledus un reakcijas sistēma jāsagatavo pēc pilnīgas atdzesēšanas. Kad sagatavošana ir pabeigta, lūdzu, uzsitiet vai pipetējiet, lai kārtīgi samaisītos. Nevajag virpināt!

1. Nepareiza sajaukšanas metode (virpulis, vardarbīgas svārstības utt.) Izraisīs neparastu bibliotēkas fragmentu izplatīšanos (kā parādīts nākamajā attēlā), tādējādi ietekmējot bibliotēkas kvalitāti. Tāpēc, sagatavojot sadrumstalotības maisījuma reakcijas šķīdumu, lūdzu, uzmanīgi pipetējiet uz augšu un uz leju, lai sajauktos, vai izmantojiet pirkstu galu, lai švīkātos un vienmērīgi samaisītu. Esiet piesardzīgs, lai nesajauktos ar virpuli.

2. Bibliotēkas celtniecībai jāizmanto augstas tīrības pakāpes DNS

■ Laba DNS integritāte: elektroforēzes josla ir lielāka par 30 kb, bez astes

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. DNS ievades daudzumam jābūt precīzam. DNS kvantitatīvai noteikšanai ir ieteicams izmantot Qubit un PicoGreen metodes, nevis Nanodrop.

4. Jānosaka EDTA saturs DNS šķīdumā EDTA ir liela ietekme uz sadrumstalotības reakciju. Ja EDTA saturs ir augsts, pirms turpmākās pārbaudes ir jāveic DNS attīrīšana.

5. Sadalīšanas reakcijas šķīdums jāsagatavo uz ledus Sadalīšanas process ir jutīgs pret reakcijas temperatūru un laiku (īpaši pēc pastiprinātāja pievienošanas). Lai nodrošinātu reakcijas laika precizitāti, lūdzu, sagatavojiet reakcijas sistēmu uz ledus.

6. Sadrumstalotības reakcijas laikam jābūt precīzam Sadrumstalotības pakāpes reakcijas laiks tieši ietekmēs fragmentu produktu lielumu, tādējādi ietekmējot DNS fragmentu sadalījumu pēc izmēra bibliotēkā.

1. Kāda veida paraugs ir piemērojams šim komplektam?

Piemērojamais šī komplekta parauga veids var būt kopējā RNS vai attīrīta mRNS ar labu RNS integritāti. Ja bibliotēkas izveidošanai tiek izmantota kopējā RNS, ieteicams vispirms izmantot rRNS samazināšanas komplektu (kat. Nr. 4992363/4992364/4992391), lai vispirms noņemtu rRNS.

2. Vai FFPE paraugus var izmantot, lai izveidotu bibliotēku ar šo komplektu?

MFNS FFPE paraugos zināmā mērā tiks degradēta ar relatīvi sliktu integritāti. Izmantojot šo komplektu bibliotēkas veidošanai, ieteicams optimizēt sadrumstalotības laiku (saīsināt sadrumstalotības laiku vai neveikt fragmentāciju).

3. Kas var izraisīt ievietotā segmenta nelielas novirzes, izmantojot izstrādājuma rokasgrāmatā norādīto izmēru izvēles soli?

Izmēru atlase jāveic stingri saskaņā ar izmēru izvēles soli šajā izstrādājuma rokasgrāmatā. Ja ir novirzes, iemesls varētu būt tas, ka magnētiskās lodītes nav līdzsvarotas līdz istabas temperatūrai vai nav pilnībā sajauktas, pipete nav precīza vai šķidrums paliek galā. Eksperimentam ieteicams izmantot padomus ar zemu adsorbciju.

4. Adapteru izvēle bibliotēku būvniecībā

Bibliotēkas konstrukcijas komplektā nav adaptera reaģenta, un šo komplektu ieteicams lietot kopā ar TIANSeq viena indeksa adapteri (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. Bibliotēkas kvalitātes kontrole

Bibliotēkas kvantitatīvā noteikšana: Qubit un qPCR tiek izmantoti, lai noteiktu bibliotēkas masas koncentrāciju un molāro koncentrāciju. Darbība ir stingri saskaņā ar produkta rokasgrāmatu. Bibliotēkas koncentrācija parasti atbilst NGS sekvencēšanas prasībām. Bibliotēkas izplatīšanas diapazona noteikšana: izmantojot Agilent 2100 Bioanalyzer, lai noteiktu bibliotēkas izplatīšanas diapazonu.

6. Pastiprināšanas cikla numura izvēle

Saskaņā ar instrukcijām PCR ciklu skaits ir 6-12, un vajadzīgo PCR ciklu skaits jāizvēlas atbilstoši parauga ievadei. Bibliotēkās ar augstu ienesīgumu pārsniegšana parasti notiek dažādās pakāpēs, kas izpaužas kā nedaudz lielāka virsotne pēc mērķa diapazona maksimuma Agilent 2100 Bioanalyzer noteikšanā, vai arī noteiktā Qubit koncentrācija ir zemāka nekā qPCR. Viegla pastiprināšana ir normāla parādība, kas neietekmē bibliotēku secību un turpmāko datu analīzi.

7. Smailes parādās Agilent 2100 Bioanalyzer noteikšanas profilā

Smaiļu parādīšanās Agilent 2100 Bioanalyzer noteikšanā ir saistīta ar nevienmērīgu paraugu sadrumstalotību, kur noteiktā izmērā būs vairāk fragmentu, un tas kļūs acīmredzamāks pēc PCR bagātināšanas. Šajā gadījumā tiek ieteikts neveikt izmēru izvēli, ti, 15 minūtes inkubācijas laikā iestatīt sadrumstalotības stāvokli uz 94 ° C, kur fragmentu sadalījums ir mazs un koncentrēts, un var uzlabot viendabīgumu.