Ultra HiFidelity PCR komplekts

Augsta precizitāte, augsta specifika un augstas efektivitātes karstās palaišanas PCR premikss.

Ultra HiFidelity PCR komplekts ir jauns augstas precizitātes PCR pastiprināšanas premikss, kas piemērots ar PCR saistītai klonēšanai un noteikšanai. Komplektā esošā Ultra HiFi DNS polimerāze ir jauna ātra un augstas precizitātes DNS polimerāze, kas izstrādāta, izmantojot virzītas molekulārās evolūcijas tehnoloģiju. Tas uzlabo DNS polimerāzes afinitāti pret veidnēm, uzlabo fermenta amplifikācijas ātrumu un pagarināšanas spēju un palielina PCR panākumu līmeni un produkta iznākumu.

Kaķis Nē Iepakojuma izmērs
4992970 1 ml
4992971 5*1 ml
4992978 5*5*1 ml

 

 


Produkta detaļas

Eksperimentāls piemērs

Bieži uzdotie jautājumi

Produktu birkas

Iespējas

■ Viegli lietojams: šis komplekts tiek piegādāts kā 2 × premikss, un PCR var veikt, vienkārši pievienojot veidnes un primerus.
■ Augsta precizitāte: precizitāte ir 50 reizes lielāka nekā Taq polimerāzei.
■ Augsta specifika: Lieliska karstās palaišanas veiktspēja, lai nodrošinātu produkta specifiku.
■ Ātra pastiprināšana: pagarinājuma ātrums var sasniegt 10-15 sekundes/kb.
■ Spēcīga paplašināmība: var pastiprināt līdz 20 kb DNS fragmentus.
■ Plaša pielietojamība: Komplektā ir PCR pastiprinātājs un tas ir piemērots augstas GC un sarežģītu veidņu pastiprināšanai.

Specifikācija

Tips: augstas precizitātes DNS polimerāze
Pastiprināšanas ātrums: 10-15 sek/kb
Fragmenta izmērs: <20kb
Pielietojums: augstas precizitātes PCR amplifikācija, gēnu klonēšana, augsta GC veidņu amplifikācija, sarežģītu genomu gēnu klonēšana, cDNS augstas precizitātes amplifikācija, SNP noteikšana, vietnei specifiska mutācija utt.
DNS ieguves raža no dažādiem augu audiem:
Piezīme: DNS iznākums ir atkarīgs no paraugu veidiem. Visi iepriekš minētie materiāli ir no maigām lapām.

Visus produktus var pielāgot ODM/OEM. Lai iegūtu sīkāku informāciju,lūdzu, noklikšķiniet uz Pielāgots pakalpojums (ODM/OEM)


  • Iepriekšējais:
  • Nākamais:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental Example Karstā palaišana, lai nodrošinātu produkta specifiku
    1. attēls. Ultra HiFi ir lieliska karstās palaišanas funkcija, lai nodrošinātu pastiprināšanas produktu specifiku. Tika izmantota molekulāro bāku metode (Ma et al., Anal Biochem, 2006).
    Experimental Example Lieliska precizitāte, 50 reizes augstāka nekā Taq polimerāze
    2. attēls. Ultra HiFi precizitāte ir 50 reizes augstāka nekā parastajai Taq polimerāzei. Taq polimerāzes polimerizācijas precizitāte (bez koriģējošas aktivitātes) tiek izmantota kā atsauce.
    Experimental Example Ātru pastiprināšanu un garus fragmentus var ātri pastiprināt
    Attēls 3. Ultra HiFi var pagarināt līdz 5 sekundēm/kb fragmentiem, kas ir mazāki par 4 kb. Gariem fragmentiem pastiprināšanas laiku var attiecīgi pagarināt. Fragmentiem, kuru lielums pārsniedz 15 kb, ātrums var būt līdz 30 sek/kb. M: TIANGEN D15000 marķieris
    Experimental Example Experimental Example Experimental Example Spēcīga universālums un augsta specifika, viegli lasāms augsts GC un gari fragmenti no dažādiem avotiem
    4. attēls. Ultra HiFi ir augsta specifika, lai nodrošinātu pastiprināšanas panākumu līmeni un produktu daudzumu dažādu veidu veidnēm.
    A. Ultra HiFi pastiprināšanas rezultāti
    B. Piegādātāja K Hi-Fi enzīmu amplifikācijas rezultāti
    C. Piegādātāja N Hi-Fi enzīmu amplifikācijas rezultāti
    M: TIANGEN D15000 marķieris
    1.-5. Josla. Dažāda garuma veidņu pastiprināšanas rezultāti: 1. 750 bp; 2. 1 kb; 3.
    2 kb; 4. 4 kb; 5. 6 kb
    6. josla. Augstas GC veidnes pastiprināšanas rezultāts: 1915 bp (GC%: 70%);
    7.-11. Josla. Dažādu genomu 2 kb veidņu pastiprināšanas rezultāts: 7. Žurka; 8.
    Rīsi; 9. Kvieši; 10. Kukurūza; 11. Baktērijas;
    12.-14. Josla. 8 kb garu fragmentu amplifikācijas rezultāts: 12. Rīsi; 13. Kukurūza;
    J: Nav pastiprināšanas joslu

    A-1 veidne

    ■ Šablons satur olbaltumvielu piemaisījumus vai Taq inhibitorus utt. —— Notīriet DNS veidni, noņemiet olbaltumvielu piemaisījumus vai ekstrahējiet veidnes DNS ar attīrīšanas komplektiem.

    ■ Šablona denaturācija nav pabeigta ——Pienācīgi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

    ■ Veidnes pasliktināšanās-atkārtoti sagatavojiet veidni.

    A-2 Primer

    ■ Slikta praimeru kvalitāte-atkārtoti sintezējiet grunti.

    ■ Gruntējuma noārdīšanās —— Saglabājiet augstas koncentrācijas praimerus nelielā tilpumā. Izvairieties no vairākkārtējas sasalšanas un atkausēšanas vai ilgstošas ​​4 ° C konservēšanas.

    ■ Nepareiza gruntējuma konstrukcija (piemēram, gruntējuma garums nav pietiekams, starp primeriem izveidojies dimērs utt.)

    A-3 Mg2+koncentrēšanās

    ■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

    A-4 Rūdīšanas temperatūra

    ■ Augsta atlaidināšanas temperatūra ietekmē gruntējuma un šablona saistīšanos. —–Samaziniet atlaidināšanas temperatūru un optimizējiet stāvokli ar 2 ° C gradientu.

    A-5 Pagarināšanas laiks

    ■ Īss pagarinājuma laiks - pagariniet pagarinājuma laiku.

    J: Viltus pozitīvs

    Parādības: Negatīvie paraugi parāda arī mērķa secības joslas.

    A-1 PCR piesārņojums

    ■ Mērķsekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums - uzmanīgi nepipetējiet paraugu, kas satur mērķa secību negatīvajā paraugā, un neizlejiet tos no centrifūgas mēģenes. Reaģentus vai aprīkojumu vajadzētu autoklāvēt, lai likvidētu esošās nukleīnskābes, un piesārņojuma esamība jānosaka ar negatīvas kontroles eksperimentiem.

    ■ Reaģentu piesārņojums —— reaģentus izlīdziniet un uzglabājiet zemā temperatūrā.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

    ■ Nepareizs gruntējuma dizains un mērķa secībai ir homoloģija ar mērķa secību. —–Pārveidojiet gruntējumus.

    J: Nespecifiska pastiprināšana

    Parādības: PCR amplifikācijas joslas neatbilst gaidāmajam izmēram, vai nu lielam, vai mazam, vai dažreiz rodas gan specifiskas amplifikācijas joslas, gan nespecifiskas amplifikācijas joslas.

    A-1 Primer

    ■ Slikta gruntējuma specifika

    ——Pārveidot gruntējumu.

    ■ Gruntējuma koncentrācija ir pārāk augsta - Pareizi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

    A-2 Mg2+ koncentrēšanās

    ■ Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta —— Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

    A-3 Termostabila polimerāze

    ■ Pārmērīgs fermentu daudzums - atbilstoši samaziniet fermentu daudzumu ar 0,5 V intervālu.

    A-4 Rūdīšanas temperatūra

    ■ Rūdīšanas temperatūra ir pārāk zema ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru vai izmantojiet divpakāpju atlaidināšanas metodi

    A-5 PCR cikli

    ■ Pārāk daudz PCR ciklu - samaziniet PCR ciklu skaitu.

    J: Patchy vai uztriepes joslas

    A-1 Primer—— slikta specifika —— pārprojektējiet grunti, mainiet gruntējuma atrašanās vietu un garumu, lai uzlabotu tā specifiskumu; vai veikt ligzdotu PCR.

    A-2 veidnes DNS

    - Šablons nav tīrs. - Attīriet veidni vai iegūstiet DNS ar attīrīšanas komplektiem.

    A-3 Mg2+ koncentrēšanās

    - Mg2+ koncentrācija ir pārāk augsta - pareizi samaziniet Mg2+ koncentrācija: optimizējiet Mg2+ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg2+ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

    A-4 dNTP

    ——DNTP koncentrācija ir pārāk augsta —–Pienācīgi samaziniet dNTP koncentrāciju

    A-5 Rūdīšanas temperatūra

    ——Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru

    A-6 cikli

    ——Pārāk daudz ciklu —— Optimizējiet cikla numuru

    J: Cik daudz veidnes DNS jāpievieno 50 μl PCR reakcijas sistēmā?
    ytry
    J: Kā pastiprināt garus fragmentus?

    Pirmais solis ir izvēlēties piemērotu polimerāzi. Parastā Taq polimerāze nevar tikt koriģēta 3'-5 'eksonukleāzes aktivitātes trūkuma dēļ, un neatbilstība ievērojami samazinās fragmentu pagarināšanas efektivitāti. Tāpēc parastā Taq polimerāze nevar efektīvi pastiprināt mērķa fragmentus, kas lielāki par 5 kb. Taq polimerāze ar īpašu modifikāciju vai cita augstas precizitātes polimerāze jāizvēlas, lai uzlabotu pagarinājuma efektivitāti un apmierinātu garu fragmentu pastiprināšanas vajadzības. Turklāt garu fragmentu pastiprināšanai ir nepieciešama arī atbilstoša gruntējuma konstrukcijas, denaturācijas laika, pagarinājuma laika, bufera pH korekcija utt. Parasti primeri ar 18-24 bp var radīt labāku ražu. Lai novērstu šablona bojājumus, denaturācijas laiks pie 94 ° C cikla laikā jāsamazina līdz 30 sekundēm vai mazāk, un laikam, līdz temperatūras paaugstināšanai līdz 94 ° C pirms amplifikācijas jābūt mazākam par 1 min. Turklāt, pagarināšanas temperatūras iestatīšana aptuveni 68 ° C un pagarinājuma laika izstrāde atbilstoši ātrumam 1 kb/min, var nodrošināt garu fragmentu efektīvu pastiprināšanu.

    J: Kā uzlabot PCR pastiprināšanas precizitāti?

    PCR amplifikācijas kļūdu līmeni var samazināt, izmantojot dažādas DNS polimerāzes ar augstu precizitāti. Starp visām līdz šim atrastajām Taq DNS polimerāzēm Pfu fermentam ir zemākais kļūdu īpatsvars un visaugstākā precizitāte (skatīt pievienoto tabulu). Papildus fermentu izvēlei pētnieki var vēl vairāk samazināt PCR mutāciju ātrumu, optimizējot reakcijas apstākļus, tostarp optimizējot bufera sastāvu, termostabilās polimerāzes koncentrāciju un optimizējot PCR cikla skaitu.

    Uzrakstiet savu ziņu šeit un nosūtiet to mums