FastKing gDNA Atklājot RT SuperMix

A-1 RNS ir noārdīta

—— Attīriet augstas kvalitātes RNS bez piesārņojuma. Materiālam, no kura ekstrahē RNS, jābūt pēc iespējas svaigākam, lai novērstu RNS noārdīšanos. Pirms RT reakcijas analizējiet RNS integritāti uz denaturēta gēla. Pēc RNS ekstrakcijas tas jāuzglabā 100% formamīdā. Ja tiek izmantots RNāzes inhibitors, sildīšanas temperatūrai jābūt <45 ° C un pH jābūt zemākai par 8,0, pretējā gadījumā inhibitors atbrīvos visu saistīto RNāzi. Turklāt šķīdumos, kas satur ≥ 0,8 mM DTT, jāpievieno RNāzes inhibitors.

A-2 RNS satur reversās transkripcijas reakciju inhibitorus

—— Reversās transkripcijas inhibitori ietver SDS, EDTA, glicerīnu, nātrija pirofosfātu, spermidīnu, formamīdu, guanidīna sāli utt. Sajauciet kontroles RNS ar paraugu un salīdziniet iznākumu ar kontroles RNS reakciju, lai pārbaudītu, vai ir inhibitors. Lai noņemtu inhibitorus, nomazgājiet RNS nogulsnes ar 70% (v/v) etanolu.

A-3 Nepietiekama primeru atkausēšana, ko izmanto cDNS pirmās virknes sintezēšanai

——Noteikt, ka atlaidināšanas temperatūra ir piemērota eksperimentā izmantotajiem praimeriem. Nejaušiem heksameriem pirms reakcijas temperatūras sasniegšanas ieteicams 10 minūtes turēt temperatūru 25 ° C temperatūrā. Gēnu specifiskajiem gruntiem (GSP) izmēģiniet citu GSP vai pārejiet uz oligo (dT) vai nejaušu heksamēru.

A-4 Neliels sākuma RNS daudzums

- Palieliniet RNS daudzumu. RNS paraugiem, kas mazāki par 50 ng, cDNS pirmās virknes sintēzē var izmantot 0,1 μg līdz 0,5 μg acetil -BSA

A-5 Mērķa secība nav izteikta analizētajos audos.

- Izmēģiniet citus audus.

A-6 PCR reakcija neizdodas

—— Divpakāpju RT-PCR gadījumā cDNS veidne PCR posmā nedrīkst pārsniegt 1/5 no reakcijas tilpuma.

A-1 Gruntējumu un veidņu nespecifiska atkvēlināšana

-Gruntējumu 3'-galā nedrīkst būt 2-3 dG vai dC. Pirmās virknes sintēzē izmantojiet gēniem raksturīgos praimerus, nevis izlases praimerus vai oligo (dT). Pirmajos ciklos izmantojiet augstāku atlaidināšanas temperatūru un pēc tam zemāku atlaidināšanas temperatūru. Izmantojiet karstās palaišanas Taq DNS polimerāzi PCR, lai uzlabotu reakcijas specifiku.

A-2 Slikts gēnu specifisko praimeru dizains

—— Ievērojiet tos pašus principus amplifikācijas primeru projektēšanā.

A-3 RNS, kas piesārņota ar genoma DNS

—— Apstrādājiet RNS ar PCR pakāpes DNāzi I. Iestatiet kontroles reakciju bez reversās transkripcijas, lai noteiktu DNS piesārņojumu.

A-4 Gruntējuma dimēra veidošana

- Izstrādāt primerus bez papildinošām sekvencēm 3 'galā.

A-5 Pārāk augsts Mg²⁺ koncentrēšanās

—— Optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējuma kombinācijai

A-6 Piesārņots ar svešu DNS

——Izmantojiet aerosoliem izturīgus uzgaļus un UDG enzīmus.

A-1 Pirmās virknes produkta saturs ir pārāk augsts

—— Samaziniet pirmās virknes produkta daudzumu parastajā PCR reakcijas posmā.

A-2 Pārāk liels primeru daudzums PCR reakcijā

—–Samazināt primer ievadi.

A-3 Pārāk daudz ciklu

—— Optimizējiet PCR reakcijas apstākļus un samaziniet PCR ciklu skaitu.

A-4 Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra

—— Palieliniet atlaidināšanas temperatūru, lai novērstu nespecifisku ierosināšanu un pagarināšanu.

A-5 Nespecifiska oligonukleotīdu fragmentu amplifikācija, ko rada DNS DNāzes noārdīšanās-ekstrahējiet augstas kvalitātes RNS, lai novērstu DNS piesārņojumu.

RT-PCR ir RNS reversā transkripcija cDNS un pēc tam reversās transkribētās cDNS izmantošana kā veidne PCR reakcijai, lai pastiprinātu mērķa fragmentu. Izvēlieties nejaušus primerus, Oligo dT un gēniem specifiskus primerus atbilstoši konkrētajiem eksperimenta apstākļiem. Visus iepriekš minētos praimerus var izmantot īsai eikariotu šūnu mRNS bez matadata struktūras.

Nejaušs gruntējums: piemērots garai RNS ar matadata struktūru, kā arī visu veidu RNS, piemēram, rRNS, mRNS, tRNS utt. Tos galvenokārt izmanto vienas veidnes RT-PCR reakcijai.

Oligo dT: Piemērots RNS ar PolyA atlikušo (prokariotu RNS, eikariotu Oligo dT rRNS un tRNS nav PolyA astes). Tā kā Oligo dT ir saistīts ar PolyA asti, RNS paraugu kvalitātei jābūt augstai, un pat neliela noārdīšanās ievērojami samazinās pilna garuma cDNS sintēzi.

Gēnu specifiskais gruntējums: papildina veidnes secību, piemērots situācijām, kad mērķa secība ir zināma.

Ir divi veidi:

1. Iekšējā atsauces metode: teorētiski cDNS ir dažāda garuma DNS fragmenti, tāpēc elektroforēzes rezultāts ir uztriepe. Ja RNS pārpilnība ir zema, neviens produkts netiks parādīts elektroforēzē, bet tas nenozīmē, ka neviens produkts netiks pastiprināts ar PCR. Parasti cDNS noteikšanai var izmantot iekšējo atsauci. Ja iekšējai atsaucei ir rezultāti, cDNS kvalitāti pamatā var garantēt (dažos gadījumos, ja mērķa gēna fragments ir pārāk garš, var būt izņēmumi).

2. Ja ir zināms gēns, ko pastiprina šī veidne, to var pārbaudīt ar šī gēna praimeriem. Iekšējās atsauces pastiprināšana nenozīmē, ka ar cDNS nav problēmu. Tā kā iekšējai atsaucei ir liels cDNS daudzums, to ir viegli pastiprināt. Ja cDNS dažādu iemeslu dēļ ir daļēji noārdīta, no varbūtības viedokļa ievērojami ietekmēs mērķa gēnu ar zemu pārpilnību PCR rezultātus. Lai gan iekšējā atsauce joprojām ir liela, pastiprinājums, visticamāk, netiks ietekmēts.

Daļēji noārdās RNS. Noteikt RNS integritāti un attīrīt

Dažādu sugu RNS saturs var būt atšķirīgs, taču kopumā ekstrahētajai kopējai RNS gēla elektroforēzē vajadzētu būt divām skaidrām 28S un 18S joslām, un pirmās joslas spilgtumam jābūt divreiz augstākam nekā pēdējam. 5S josla norāda, ka RNS ir degradēta, un tās spilgtums ir proporcionāls noārdīšanās pakāpei. Veiksmīga iekšējās atsauces pastiprināšana nenozīmē, ka ar RNS nav problēmu, jo iekšējā atsauce ir lielā pārpilnībā, RNS var pastiprināt, ja vien degradācija nav smaga. OD₂₆₀/OD₂₈₀tīras RNS attiecībai, ko mēra ar spektrofotometru, jābūt no 1,9 līdz 2,1. Neliels proteīnu piemaisījumu daudzums RNS samazinās attiecību. Kamēr vērtība nav pārāk zema, RT netiks ietekmēta. RT vissvarīgākā ir RNS integritāte.

Iekšējā atsauces gēna paplašināšana var norādīt tikai uz to, ka RT ir izdevies, bet tas ne vienmēr ir saistīts ar cDNS virknes kvalitāti. Tā kā iekšējie atsauces fragmenti parasti ir nelieli un izteiksmīgi, tiem ir vieglāk gūt panākumus reversā transkripcijā. Tomēr mērķa gēna lielums un ekspresija dažādiem gēniem atšķiras. Par cDNS kvalitāti nevar spriest tikai ar iekšēju atsauci, īpaši mērķa fragmentiem, kas garāki par 2 kb.

Dažiem paraugiem ir sarežģītas sekundārās struktūras, vai tiem ir bagāts GC saturs, vai arī tie ir vērtīgi ar mazu pārpilnību. Šādos gadījumos atbilstoša reversā transkriptāze jāizvēlas atbilstoši mērķa fragmenta un parauga lielumam. RNS veidnēm ar augstu GC saturu un sarežģītu sekundāro struktūru ir grūti atvērt sekundāro struktūru zemā temperatūrā vai ar parasto reverso transkriptāzi. Šīm veidnēm var izvēlēties Quant Reverse Transcriptase, jo tās reversās transkripcijas veiktspēja acīmredzami ir labāka nekā M-MLV sērijas reversās transkriptāzes veiktspēja, kas var efektīvi mainīt dažādu RNS veidņu atšifrēšanu un maksimāli pārrakstīt RNS cDNS pirmajā virknē. Izmantojot vispārējo reversās transkriptāzes komplektu, 20 μl sistēma var efektīvi mainīt tikai 1 μg kopējās RNS. Lūdzu, pievērsiet uzmanību komplekta maksimālajai RT ietilpībai. Ja veidni pievieno pārāk daudz, reversā transkripcija dos priekšroku RNS ar lielu pārpilnību. Tāpēc labāk nepārsniegt sistēmas maksimālo jaudu.

A-1 Nosakiet, vai RNS ir stipri degradēta un vai RT ir veiksmīga

Parasti iekšējās atsauces pastiprināšanas neveiksmes iemeslu bieži izraisa nopietna RNS degradācija. Vēl viens iespējamais iemesls ir reversās transkripcijas kļūme. Iekšējo atsauci nevar izmantot kā standartu, lai novērtētu cDNS vienvirziena kvalitāti, bet to var izmantot kā standartu, lai novērtētu, vai reversā transkripcija ir veiksmīga, ja nav problēmu ar RNS kvalitāti. Reversās transkripcijas procesā vissvarīgākais ir uzturēt nemainīgu temperatūru un nemainīgu reakcijas sistēmu, lai uzlabotu reakcijas efektivitāti.

A-2 Nosakiet, vai primeri iekšējo atsauces gēnu pastiprināšanai ir uzticami un vai ir kādas problēmas ar reaģentiem, ko izmanto PCR.

Relatīvai kvantitatīvai noteikšanai RNS ir jānosaka kvantitatīvi pirms reversās transkripcijas, kas ir nepieciešama arī daudzos reversās transkripcijas komplektos, piemēram, lai noteiktu RNS ievadi kā 1 μg. Tā kā apgrieztā transkribētā cDNS ir jaukts šķīdums, ieskaitot RNS, oligo dT, fermentu, dNTP un pat nelielu DNS atlikumu, tiks izraisīta novirze, tāpēc nav iespējams precīzi noteikt cDNS. Tāpēc ir nepieciešama RNS kvantitatīva noteikšana. Ņemot vērā, ka reversās transkripcijas efektivitāte dažādiem paraugiem ir vienāda, iegūtā cDNS daudzumam jābūt vienādam, un kvantitatīvā analīze var parādīt dažādu gēnu ekspresijas līmeņu salīdzinājumu tādā pašā kopējā RNS daudzumā. Veicot relatīvo fluorescences kvantitatīvo PCR, kvantitatīvā cDNS var nebūt nepieciešama pēc reversās transkripcijas, jo iekšējo atsauces gēnu var izmantot kā atsauci.

Tas galvenokārt ir saistīts ar gēniem, un garā fragmenta reversā transkripcija vairumam gēnu nav iespējama. Pirmkārt, reversās transkripcijas efektivitāte ir daudz zemāka nekā PCR. Otrkārt, GC bagātais reģions un daudzu gēnu sekundārā struktūra ierobežo gan reverso transkripciju, gan PCR. Visbeidzot, PCR precizitāti un pastiprināšanas efektivitāti ir grūti vienlaikus garantēt. Reversās transkripcijas procesā neviens nevar garantēt, ka tiks iegūts garš fragments zemu kopiju gēniem, īpaši izmantojot oligo dT. Kas attiecas uz 5 'UTR ar lielāku GC, tas ir vēl grūtāk. Tāpēc joprojām ir saprātīga metode, kā mainīt transkripciju ar nejaušiem primeriem, atrast dabiskās šķelšanās vietas mērķa fragmentā, pastiprināt pa segmentiem un pēc tam veikt restrikcijas šķelšanu un ligēšanu. Kopumā ir grūti tieši pastiprināt fragmentus, kas lielāki par 2 kb, bet ne vienmēr ir iespējams iegūt: 1. Pirmkārt, garantējiet RNS/mRNS integritāti, un priekšroka tiek dota TRIZOL ekstrakcijai. 2. M-MLV RT-PCR komplektu var tieši izmantot. Pagariniet atlaidināšanas laiku un pareizi palieliniet cikla skaitu pastiprināšanas procesā. Alternatīvi var izmantot ligzdotu PCR vai vispirms veikt vienu vai divas reakcijas ar attiecīgi pagarinātu denaturācijas un pagarinājuma laiku pirms normālas PCR amplifikācijas, kas var palīdzēt pagarināt fragmentus. Pievērsiet uzmanību polimerāzes precizitātei. 3. Lai iegūtu ideālus rezultātus, PCR var izmantot Long Taq. 4. Lai izmantotu olbaltumvielu ekspresiju, jāpielieto augstas precizitātes polimerāze.

TIANGEN piedāvā divu veidu reverso transkriptāzi: Quant/King RTase un TIANScript M-MLV. Galvenā atšķirība starp tām ir veidņu ievades daudzums. Quant ir unikāla reversā transkriptāze, kas atšķiras no parasti izmantotā M-MLV, kas iegūts no Moloney peles leikēmijas vīrusa. Quant ir jauna augstas efektivitātes reversā transkriptāze, ko rekombinanti izsaka inženierijas Escherichia coli. Quant ir piemērots 50 ng-2 μg RNS pastiprināšanai ar augstu reversās transkripcijas aktivitāti un augstu ražu. Salīdzinot ar parasto MMLV vai AMV, Kvanta lielākā iezīme ir tā, ka tai ir ļoti spēcīga afinitāte ar RNS veidnēm un tā var mainīt transkripta sarežģītās veidnes bez denaturācijas augstā temperatūrā. Veidnēm ar lielāku GC saturu reversā efektivitāte ir augstāka. Tomēr šai reversajai transkriptāzei ir RNāzes H aktivitāte, kas var ietekmēt cDNS produkta garumu (piemērots <4,5 kb veidnēm). Parastajai reversajai transkripcijai ir ieteicama TIANScript MMLV reversā transkriptāze. Šī RTāze ir modificēts enzīms ar ļoti vāju RNāzes H aktivitāti, kas ir piemērots garai (> 5 kb) cDNS sintēzei.

Viena soļa reversā transkripcija un PCR amplifikācija tiek pabeigta vienā mēģenē, neatverot caurules vāku starp cDNS sintēzi un amplifikāciju, kas palīdz samazināt piesārņojumu. Tā kā visi iegūtie cDNS paraugi tiek izmantoti amplifikācijai, jutība ir augstāka, vismaz 0,01 pg kopējās RNS. Veiksmīgam vienpakāpju RTPCR cDNS sintēzes uzsākšanai parasti tiek izmantoti gēniem specifiski praimeri. Divpakāpju metode, proti, reversā transkripcija un PCR amplifikācija, tiek veikta divos posmos. Pirmkārt, reversā transkripcija tiek veikta no RNS veidnes, lai iegūtu cDNS, un iegūtā cDNS tiek pakļauta vienai vai vairākām dažādām PCR reakcijām. Divpakāpju metode var izmantot oligo (dT) vai nejaušus praimerus, lai vadītu cDNS pirmās virknes sintēzi, un var apgriezt visu mRNS informāciju no konkrēta parauga.