Asins tiešās PCR komplekts

Ātra mērķa gēna amplifikācija tieši, izmantojot asinis kā veidni bez ekstrakcijas.

Šis komplekts izmanto ģenētiski modificētu anti-inhibitoru DNS polimerāzi, lai efektīvi pastiprinātu vienas kopijas gēnus cilvēka genomā. Labi optimizēta bufera sistēma šajā komplektā palīdz polimerāzei stingri pretoties PCR inhibitoru inhibīcijai, tādējādi var tieši pastiprināt DNS, izmantojot asinis un kultivētas šūnas kā veidnes. Šis produkts ir viegli lietojams un neprasa sarežģītus pasākumus, piemēram, DNS attīrīšanu vai paraugu pirmapstrādi.
Šis komplekts tiek piegādāts kā 2 × MasterMix, un reakciju var veikt, vienkārši pievienojot asins veidni un atbilstošos noteikšanas praimerus. To var lietot uz kultivētām zīdītāju šūnām, piemēram, cilvēkiem, pelēm, cūkām, liellopiem un citām sugām, kā arī svaigām vai 4 ° C temperatūrā konservētām pilnām asinīm, antikoagulantiem (EDTA, citrāts, heparīns), sašķidrinātiem asins recekļiem un sausiem asins plankumiem glabājas uz Whatman 903 un FTA Elute komerckartēm.

Kaķis Nē	Iepakojuma izmērs
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Nosūtiet mums e -pastu

Produkta detaļas

Eksperimentāls piemērs

Bieži uzdotie jautājumi

Produktu birkas

Iespējas

■ Vienkārši un ātri: PCR amplifikāciju var veikt tieši, izmantojot asinis kā šablonu, bez nepieciešamības veikt garlaicīgus parauga sagatavošanas un DNS ekstrakcijas soļus.
■ Augsta tīrība: Paraugu pirmapstrādes un DNS ekstrakcijas soļu izlaišana var palīdzēt izvairīties no paraugu savstarpējas inficēšanās.
■ Augsta caurlaidspēja: liela mēroga paraugu PCR identifikāciju var veikt, apvienojot komplektu ar 96/384 iedobju PCR plāksnēm.
■ Spēcīga universālums: Šis komplekts var efektīvi pastiprināt augstas GC fragmentus vai fragmentus ar sarežģītu sekundāro struktūru, un pastiprinājuma garums var būt līdz 5 kb.
■ Spēcīga izturība pret stresu: šo komplektu var izmantot dažādām sugām un dažādu veidu asins paraugiem.

Lietojumprogrammas

Šī komplekta PCR produktu 3′ galā ir “A”, ko var tieši izmantot TA vektora klonēšanai. Šo komplektu var izmantot genoma DNS fragmentu pastiprināšanai, augstas caurlaidības ģenētiskajai analīzei un genotipizācijas (piemēram, gēnu noteikšanas) analīzei.

Visus produktus var pielāgot ODM/OEM. Lai iegūtu sīkāku informāciju,lūdzu, noklikšķiniet uz Pielāgots pakalpojums (ODM/OEM)

Iepriekšējais: TIANcombi DNS Lyse & Det PCR komplekts

Nākamais: Peles audu tiešais PCR komplekts

	Izmantojot cilvēka EDTA antikoagulāciju kā veidni, 4 gēni ar atšķirīgu GC saturu tika pastiprināti ar Blood Direct PCR komplektu. PCR reakcijas sistēma bija 20 μl, un par veidni tika izmantota 1 μl asiņu. M: TIANGEN Marķieris II; 1: fragmenta izmērs 1090 bp, GC saturs 68,1%; 2: fragmenta izmērs 1915 bp, GC saturs 70,4%; 3: fragmenta izmērs 448 bp, GC saturs 74,8%; 4: fragmenta izmērs 1527 bp, GC saturs 61,5%. Eksperimentālie rezultāti: Blood Direct PCR komplekts var efektīvi pastiprināt DNS fragmentus ar GC saturu 61,5%-74,8%robežās, kas liecina, ka tas spēj pastiprināt augstas GC fragmentus.
	Izmantojot cilvēka EDTA antikoagulāciju kā veidni, 5 gēni ar dažādu garumu (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 un Hn4.0) tika pastiprināti ar Blood Direct PCR komplektu. PCR reakcijas sistēma bija 20 μl, un par veidni tika izmantota 1 μl asiņu. M: TIANGEN Marķieris II; 1-3: 3 dažādi asins paraugi; NTC: kontrole bez primeriem. Eksperimentālie rezultāti: Blood Direct PCR komplekts var pastiprināt fragmentus, kuru garums ir līdz 4 kb, kas liecina, ka tas spēj pastiprināt garus fragmentus.
	Kā veidni izmantojot cilvēka EDTA antikoagulāciju, dažādu asins paraugu PCR noteikšanai tika izmantots Blood Direct PCR komplekts. PCR reakcijas sistēma bija 20 μl, un par veidni tika izmantota 1 μl asiņu. M: TIANGEN Marķieris II; 1-9: asiņu iekraušanas daudzums ir attiecīgi 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl un 5 μl; NTC: vadība bez veidnes Eksperimentālie rezultāti: Blood Direct PCR Kit ir spēcīga izturība pret asinīm un var pastiprināt asins paraugus ar iekraušanas diapazonu 0,1-5 μl.
	Cilvēku, žurku, vistu un citu sugu asins paraugi ar dažādu apstrādi tika izmantoti kā veidnes. Asins tiešais PCR komplekts tika izmantots, lai pastiprinātu PRNP (cilvēka, 750 bp), aktīnu (žurka, 200 bp) un β-aktīnu (vistas, 1,0 kb). PCR reakcijas sistēma bija 20 μl, un par veidni tika izmantota 1 μl asiņu. M: TIANGEN Marķieris II. Eksperimentālie rezultāti: Blood Direct PCR komplektu var izmantot plašam paraugu klāstam, un tiešu PCR noteikšanu var veikt dažādu sugu asins paraugiem ar dažādu apstrādi.

J: Nav pastiprināšanas joslu

A-1 veidne

■ Šablons satur olbaltumvielu piemaisījumus vai Taq inhibitorus utt. —— Notīriet DNS veidni, noņemiet olbaltumvielu piemaisījumus vai ekstrahējiet veidnes DNS ar attīrīšanas komplektiem.

■ Šablona denaturācija nav pabeigta ——Pienācīgi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

■ Veidnes pasliktināšanās-atkārtoti sagatavojiet veidni.

A-2 Primer

■ Slikta praimeru kvalitāte-atkārtoti sintezējiet grunti.

■ Gruntējuma noārdīšanās —— Saglabājiet augstas koncentrācijas praimerus nelielā tilpumā. Izvairieties no vairākkārtējas sasalšanas un atkausēšanas vai ilgstošas 4 ° C konservēšanas.

■ Nepareiza gruntējuma konstrukcija (piemēram, gruntējuma garums nav pietiekams, starp primeriem izveidojies dimērs utt.)

A-3 Mg²⁺koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Augsta atlaidināšanas temperatūra ietekmē gruntējuma un šablona saistīšanos. —–Samaziniet atlaidināšanas temperatūru un optimizējiet stāvokli ar 2 ° C gradientu.

A-5 Pagarināšanas laiks

■ Īss pagarinājuma laiks - pagariniet pagarinājuma laiku.

J: Viltus pozitīvs

Parādības: Negatīvie paraugi parāda arī mērķa secības joslas.

A-1 PCR piesārņojums

■ Mērķsekvences vai amplifikācijas produktu savstarpējs piesārņojums - uzmanīgi nepipetējiet paraugu, kas satur mērķa secību negatīvajā paraugā, un neizlejiet tos no centrifūgas mēģenes. Reaģentus vai aprīkojumu vajadzētu autoklāvēt, lai likvidētu esošās nukleīnskābes, un piesārņojuma esamība jānosaka ar negatīvas kontroles eksperimentiem.

■ Reaģentu piesārņojums —— reaģentus izlīdziniet un uzglabājiet zemā temperatūrā.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk zema - Pareizi palieliniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

■ Nepareizs gruntējuma dizains un mērķa secībai ir homoloģija ar mērķa secību. —–Pārveidojiet gruntējumus.

J: Nespecifiska pastiprināšana

Parādības: PCR amplifikācijas joslas neatbilst gaidāmajam izmēram, vai nu lielam, vai mazam, vai dažreiz rodas gan specifiskas amplifikācijas joslas, gan nespecifiskas amplifikācijas joslas.

A-1 Primer

■ Slikta gruntējuma specifika

——Pārveidot gruntējumu.

■ Gruntējuma koncentrācija ir pārāk augsta - Pareizi paaugstiniet denaturācijas temperatūru un pagariniet denaturācijas laiku.

A-2 Mg²⁺ koncentrēšanās

■ Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta —— Pareizi samaziniet Mg2+ koncentrāciju: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-3 Termostabila polimerāze

■ Pārmērīgs fermentu daudzums - atbilstoši samaziniet fermentu daudzumu ar 0,5 V intervālu.

A-4 Rūdīšanas temperatūra

■ Rūdīšanas temperatūra ir pārāk zema ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru vai izmantojiet divpakāpju atlaidināšanas metodi

A-5 PCR cikli

■ Pārāk daudz PCR ciklu - samaziniet PCR ciklu skaitu.

J: Patchy vai uztriepes joslas

A-1 Primer—— slikta specifika —— pārprojektējiet grunti, mainiet gruntējuma atrašanās vietu un garumu, lai uzlabotu tā specifiskumu; vai veikt ligzdotu PCR.

A-2 veidnes DNS

- Šablons nav tīrs. - Attīriet veidni vai iegūstiet DNS ar attīrīšanas komplektiem.

A-3 Mg²⁺ koncentrēšanās

- Mg²⁺ koncentrācija ir pārāk augsta - pareizi samaziniet Mg²⁺ koncentrācija: optimizējiet Mg²⁺ koncentrācija ar virkni reakciju no 1 mM līdz 3 mM ar intervālu 0,5 mM, lai noteiktu optimālo Mg²⁺ koncentrācija katrai veidnei un gruntējumam.

A-4 dNTP

——DNTP koncentrācija ir pārāk augsta —–Pienācīgi samaziniet dNTP koncentrāciju

A-5 Rūdīšanas temperatūra

——Pārāk zema atlaidināšanas temperatūra ——Pienācīgi paaugstiniet atlaidināšanas temperatūru

A-6 cikli

——Pārāk daudz ciklu —— Optimizējiet cikla numuru

J: Cik daudz veidnes DNS jāpievieno 50 μl PCR reakcijas sistēmā?

J: Kā pastiprināt garus fragmentus?

Pirmais solis ir izvēlēties piemērotu polimerāzi. Parastā Taq polimerāze nevar tikt koriģēta 3'-5 'eksonukleāzes aktivitātes trūkuma dēļ, un neatbilstība ievērojami samazinās fragmentu pagarināšanas efektivitāti. Tāpēc parastā Taq polimerāze nevar efektīvi pastiprināt mērķa fragmentus, kas lielāki par 5 kb. Taq polimerāze ar īpašu modifikāciju vai cita augstas precizitātes polimerāze jāizvēlas, lai uzlabotu pagarinājuma efektivitāti un apmierinātu garu fragmentu pastiprināšanas vajadzības. Turklāt garu fragmentu pastiprināšanai ir nepieciešama arī atbilstoša gruntējuma konstrukcijas, denaturācijas laika, pagarinājuma laika, bufera pH korekcija utt. Parasti primeri ar 18-24 bp var radīt labāku ražu. Lai novērstu šablona bojājumus, denaturācijas laiks pie 94 ° C cikla laikā jāsamazina līdz 30 sekundēm vai mazāk, un laikam, līdz temperatūras paaugstināšanai līdz 94 ° C pirms amplifikācijas jābūt mazākam par 1 min. Turklāt, pagarināšanas temperatūras iestatīšana aptuveni 68 ° C un pagarinājuma laika izstrāde atbilstoši ātrumam 1 kb/min, var nodrošināt garu fragmentu efektīvu pastiprināšanu.

J: Kā uzlabot PCR pastiprināšanas precizitāti?

PCR amplifikācijas kļūdu līmeni var samazināt, izmantojot dažādas DNS polimerāzes ar augstu precizitāti. Starp visām līdz šim atrastajām Taq DNS polimerāzēm Pfu fermentam ir zemākais kļūdu īpatsvars un visaugstākā precizitāte (skatīt pievienoto tabulu). Papildus fermentu izvēlei pētnieki var vēl vairāk samazināt PCR mutāciju ātrumu, optimizējot reakcijas apstākļus, tostarp optimizējot bufera sastāvu, termostabilās polimerāzes koncentrāciju un optimizējot PCR cikla skaitu.

Uzrakstiet savu ziņu šeit un nosūtiet to mums